一、冷冻干燥过程研究

 真空冷冻干燥是先将制品冻结到共晶点温度以下，使水分变成固态的冰，然后在适当的温度和真空度下，使冰升华为水蒸气。再用真空系统的冷凝器(水汽凝结器)将水蒸气冷凝，从而获得干燥制品的技术。该过程主要可分为：制品准备、预冻、一次干燥（升华干燥）、二次干燥（解吸干燥）和密封保存五个步骤。

 1 产品预冻

1.1 制品的玻璃化

玻璃化的作用。近年来，人们已经逐渐地认识到，凡是成功的低温保存，细胞内的水均以玻璃态的形式被固化，在胞内不出现晶态的冰。玻璃化是指物质以非晶态形式存在的一种状态，其粘度极大，分子的能动性几乎为零，由于这种非晶体结构的扩散系数很低，故在这种结构中分子运动和分子变性反应非常微弱，不利的化学反应能够被抑制，从而提高被保存物质的稳定性。

玻璃化的获得。在产品预冻时，只要降温速率足够快，且达到足够低的温度，大部分材料都能从液体过冷到玻璃态固体。“足够快”的意思是在降温过程中迅速通过结晶区而不发生晶化，“足够低”指的是必须把温度降到玻璃化转变温度Tg以下。

对于具有一定初始浓度的细菌制品，其预冻过程一般通过“两步法”来完成。第一步是以一般速率进行降温，让细胞外的溶液中产生冰，细胞内的水分通过细胞膜渗向胞外，胞内溶液的浓度逐渐提高；第二步是以较高速率进行降温，以实现胞内溶液的玻璃化。此法又称“部分玻璃化法”。

 当初始浓度为A的溶液（A点）从室温开始冷却时，随着温度的下降，溶液过冷到B点后将开始析出冰，结晶潜热的释放又使溶液局部温度升高。溶液将沿着平衡的熔融线不断析出冰晶，冰晶周围剩余的未冻溶液随温度下降，浓度不断升高，一直下降到熔融线(Ta)与玻璃化转变曲线(Tg)的交点(D点)时，溶液中剩余的水分将不再结晶(称为不可冻水)，此时的溶液达到最大冻结浓缩状，浓度较高，以非晶态的形式包围在冰晶周围，形成镶嵌着冰晶的玻璃体。

  1.2降温速率与预冻温度

预冻速度决定了制品体积大小、形状和成品最初晶格及其微孔的特性，其速度可控制在每分钟降温1℃左右。

对结晶性制剂而言，冻结速度一般不要太慢，冻结速度慢虽然便于形成大块冰晶体，维持通畅的升华通道，使升华速度加快，但如果结晶过大、晶核数量过少、制剂的结晶均匀性差，也不利于升华干燥。对于一些分子呈无规则网状结构的高分子药物，速冻能使其在药液中迅速定型，使包裹在其中的溶媒蒸汽在真空条件下迅速逸出，反而能使升华速度加快。因此，溶液的最佳冷冻速度是因制剂本身的特性不同而变化的。如蛋白多肽类药物的冻干，慢速冻结通常是有利的，而对于病毒、疫苗来说，快速降温通常是有利的。20世纪60年代，人们成功地保存了哺乳动物的某些细胞，其降温程序是：以1℃/min降到-15℃，然后以4-5℃/min降到-79℃，这一程序与前面所提及的“两步法”是一致的。但也有降温更慢和更快的事例，如红细胞和仓鼠细胞的最佳冷却速率超过50℃/min，而保存淋巴细胞的降温速率只有0.1℃/min。

预冻温度须低于制品的玻璃态和橡胶态转变温度，以保证箱内所有的制品温度都低于共熔点，使其全部凝结成固体；对于许多溶液，它们的玻璃化转变温度一般要比共晶点低10-30°。至于预冻的最终温度是控制在低于共晶温度还是低于玻璃化转变温度，这主要取决于我们希望制品在冻结过程中所达到的固化状态。对于具有类似膜结构或活性成分制品的冷冻干燥，应尽量使其最终冻结温度低于玻璃化转变温度。一般制品预冻温度在共熔点以下10-20℃保持2-3h，保证冷冻完全；多数疫苗的共熔点在-15℃到-20℃之间，因此预冻温度要在-25℃到-40℃。目前最常用的一种冷冻方法是冻干机板层冷冻。

 2一次干燥

一次干燥（升华干燥）是指低温下对制品加热，同时用真空泵抽真空，使其中被冻结成冰的自由水直接升华成水蒸气。待成品中看不到冰时，则可认为一次干燥已完毕，此时制品温度迅速上升，接近板温，制品中最初水分的90%以上已被除去。

2.1一次干燥中制品温度的控制

在升华干燥过程中，制品吸收热量后所含水分在真空下升华成水蒸气，消耗大量热能，使得制品温度较板层温度低十几甚至几十度。多数动物用疫苗一次干燥应在-30℃或以上温度（低于产品塌陷温度尤其是共熔点温度）下进行，因此板层温度一般在-10～-3℃之间。如果温度过高，会出现软化、塌陷等现象，造成冻干失败；如果温度过低，不仅给制冷系统提出了过高的要求，而且大大降低了升华过程的速率，费时又耗能。尽管在有些场合下，一次干燥的最大许可温度由制品的相变温度或共晶温度决定，但更一般的情况下，预冻的制品中都有一定份额的无定形态，故应当将冻干的一次干燥过程控制在Tg以下进行。

在干燥过程中，如制品干燥层温度上升到一定数值时，其部分干燥物质所形成的多孔性骨架刚度降低，干燥层内颗粒出现脱落，直至骨架塌陷，造成已被干燥部分的微孔通道被封闭，阻止升华的进行，使升华速率减慢，最终可导致冻干产品的残余水分含量过高，产品的复水性与稳定性差。此时的温度称为塌陷温度Tc。塌陷温度Tc是在冻干过程中样品所特有的特征温度，是由制品材料及干燥层的多孔性结构所决定。有人认为，在多数情况下，塌陷温度Tc要比玻璃化转变温度Tg高20°左右。对于一个特定的冻干制品，其共晶温度、玻璃化转变温度可通过DSC（差式扫描量热法）测得，而塌陷温度可通过冻干显微镜和介电分析测得。

目前大多数的操作，都是在整个升华干燥过程中保持加热温度不变。关于是否应当这样，存在两种不同的观点。一种观点认为，在升华干燥阶段，随着水分的升华，使制品浓度升高，其玻璃化转变温度也会提高，这样升华干燥过程中就可以适当逐渐提高温度，加快升华进行；另一种观点认为，在升华干燥阶段，升华的只是游离在网状结构空隙中的自由水，不会对物料实体的玻璃化转变温度产生影响，因此升华干燥过程中的加热温度仍应保持不变。实际上这两种情况都可能出现，是和冷却固化的情况有关的。

2.2一次干燥中冷阱温度的控制

冷阱位于真空泵进口前，升华产生的水蒸气靠压差的作用到达冷阱，重新结成霜，如果没有冷阱或其温度不够低，就会导致冻干室内水蒸汽压升高，制品升华界面压力和温度都会上升，导致制品融化。对于多数制品的冷冻干燥，冷阱表面温度在-40—-50℃之间已能满足要求。

2.3一次干燥中的真空度

一次干燥中真空度应维持13.33-26.66pa。一般说来，在升华干燥过程中真空度是维持不变的，但也可以采用循环压力法，即控制真空系统的压力在一定范围内上下波动，以期提高干燥速度。大量研究表明，在干燥过程中短期地略微提高干燥室压力（10-20Pa），同时干燥层表面温度维持在接近其允许值，可以缩短干燥时间。但干燥室压力必须低于升华界面压力，而升华界面的压力所对应的升华界面温度必须低于制品在相应浓度下的玻璃化转变温度。在升华过程中，有时可采用向冻干箱内充注气体，以形成对流传热，但这一部分空气量会降低真空度，因此，要对真空度进行控制，使其既能形成恰当的对流传热，又能使制剂表面始终处于匀速干燥的压力状态。

2.4影响干燥效率的因素

在一次干燥过程中，除了制品温度、冷阱温度、干燥室压力影响干燥快慢以外，预冻速度也影响着升华效率。慢冻形成大冰晶，升华后形成大的孔隙，有利于升华进行，干燥速度快；速冻形成细小的冰晶，升华后留下细小的通道，干燥速度慢。但慢冻时，溶质可能发生迁移，以至于在表面形成一层硬壳，阻止升华进行。

近年来发现，在冻干配方中加入5%左右叔丁醇后，冻结时会形成针状结晶，冰晶升华后留下了管状通道，使水蒸气阻力大大减小，升华速率显著提高，节省了时间和能耗。

 3 二次干燥

二次干燥（解吸干燥）是在较高的温度下对制品加热，使制品中被吸附的部分“束缚水”解吸变成“自由”的液态水再吸热蒸发成水蒸气的过程，加热量主要用于被束缚水的解吸作用和蒸发。由于升华干燥之后，在干燥制品的多孔结构表面和极性集团上结合水的吸附能量很大，因此必须提供较高的温度和足够的热量才能实现结合水的解吸过程。该过程中，制品的含水量不断减少，其玻璃化转变温度是不断提高的，制品温度也可以逐渐提高。

在二次干燥过程中，板层温度至少每小时增加5℃-10℃。成品温度应该迅速升至板层温度或以上，否则制品水分增多且易倒塌。

二次干燥目的虽然是使残存在多孔疏松状固体中的水被去除，但适当的水分（通常1-1.5%）对于保持疫苗结构完整性和活性也是必要的。制品水分过低，菌体表面亲水基团失去保护，会直接与氧接触，影响菌体的存活率。最终板层温度是成品水分含量的一个主要决定因素，其数值不能超过制品的最高允许温度，对于蛋白质药物其最高允许温度一般应低于40℃，对于绝大多数动物用疫苗，最终板层温度应该在25℃-35℃之间。一般细菌性产品最终板层温度为30℃-35℃，病毒性产品为25℃。

 4 密封保存

冻干结束后，通过板层液压升降系统，将半加塞的疫苗瓶在真空状态下密封。使用的管状玻璃瓶和胶塞应配套，将其密封后置45℃水浴24小时，观察疫苗瓶中是否有水被吸入。真空密封的完整性应在温度压力下评估，简单的试验是将成品在45℃水浴24小时，观察疫苗瓶中是否有水被吸入。胶塞应该在135℃干燥4小时，高压灭菌胶塞可使疫苗的水分提高2-5%。

二、叔丁醇在冻干制剂中的应用研究

冷冻干燥工艺已经被广泛地应用于药物制剂的制备过程中。通常情况下，水是惟一的溶剂，但有时候药物在萃取和结晶过程中残留的有机溶剂，也可能会被带入到最后的冻干溶液中，这样会导致一些新的变化，含少量有机溶剂的溶液的冻干工艺引起人们的关注，并被深入研究。叔丁醇-水共溶剂就是其中最常见的，以它为溶剂进行冷冻干燥的工艺可以用于多种制剂的制备，具有多方面优势。

　　由于叔丁醇作为冻干剂具有多重优势，已被广泛用于制剂中，纯的叔丁醇可以单独作为溶剂，溶解水不溶性药物或水中稳定性不好的药物，进行冻干。国内外研究较多是叔丁醇与水形成共溶剂体系进行冷冻干燥，其在药剂领域中应用有多方面。

　　■制备固体制剂具明显优势

　　难溶于水的药物溶于叔丁醇中，水溶性物质溶解于水中，两者以适当的比例混合，得到可以共同溶解水溶性与脂溶性物质的澄明共溶剂，此溶液经进一步冻干可以得到固体分散体。采用这种工艺制备药剂具有多种好处。

　　加快药物的升华速度 研究发现，将溶解庆大霉素的叔丁醇溶液与乳糖水溶液以合适的比例混合形成共溶剂后冻干，其冻干周期可由39小时缩短为28小时，同时所得冻干产品仍保持多孔性。

　　提高药物的稳定性 前列腺素E为稳定性很差的药物，采用体积分数为20%的叔丁醇-水共溶剂将药物和乳糖共同溶解，冻干后得到稳定冻干粉针。目前，采用此冻干工艺生产的前列腺素E无菌粉末制剂已在国外上市。

　　增溶难溶性药物 Aldipine是一种从海洋生物中提取的抗癌活性物质，其相对分子质量为1109，在水中几乎不溶。研究人员探索到一种新的增溶方法：将药物先溶于叔丁醇中，再与乳糖水溶液按体积比4∶6的比例形成澄明共溶剂，进行冻干，得到稳定的冻干物，使用前采用聚氧乙烯蓖麻油-乙醇-水共溶剂系统来复溶，生理盐水稀释后注射给药。

　　简化制备固体分散体工艺 最近，研究人员将脂溶性药物连同水溶性寡糖共溶于叔丁醇-水共溶剂体系，冻干后制成固体分散体。采用此方法可以将脂溶性药物分散在一些玻璃化温度较高的无定型辅料中，使药物保持在无定型状态，可显著提高药物的溶解速度和药物的溶解度。这种工艺可以避免用熔融法制备固体分散体对热稳定性差的药物的破坏，也能避免采用溶剂法制备固体分散体时使用氯仿、二氯甲烷等毒性较大的溶剂。

　　促进药物结晶 叔丁醇-水共溶剂体系制备固体分散体可以使药物保持在无定型状态。另一方面，叔丁醇也可用来促进难结晶药物的结晶。这是因为，叔丁醇的加入会改变水的结晶状态，进而也会使溶在水中的药物结晶状态发生改变。对抗生素头孢噻吩钠的研究发现，加入少量的叔丁醇可以使很难结晶的药物得到针状的结晶。磷霉素钠属难冻结的物质，因为药物和水的结合力很强，形成水合物的凝固点急剧下降到零下50℃左右，普通的冻干机很难将其冻结，同时很低的温度也使药物的冻干周期大大延长。而加入叔丁醇后，由于叔丁醇与水的结合力较强，使得共溶剂系统的凝固点升高，同时大大地提高了升华速度。

　　■制备多种分散体系

　　制备脂质体 以叔丁醇作为溶剂溶解磷脂，经冻干后得到结构疏松的磷脂固体，加入水可以迅速水化制成脂质体。这种方法类似薄膜分散法，可以制得粒径较大的微米级多室脂质体，这种脂质体制备工艺已经应用于试验和规模生产。

　　最近，沈阳药科大学的科研人员发明了一种新的脂质体制备工艺，即将相变温度低的大豆磷脂溶于叔丁醇，进一步与蔗糖水溶液按适当比例混合，得到澄明溶液，冻干得到固体分散体，加水水化，即可得到粒径均匀的小单室脂质体。该工艺解决了脂质体稳定性不好的问题，建立了一个形成小单室脂质体的模型。在冻干过程中，磷脂的叔丁醇溶液先析出结晶，这种结晶的形成被黏度较大的糖溶液限制，只能形成较小的粒径。同时，在析出结晶这个相分离的过程中，磷脂作为一种表面活性剂，吸附在两相的界面上，降低表面张力，即磷脂包裹的叔丁醇分散在糖基质中，最终形成一种类似乳剂的状态。吸附在两相界面的磷脂在冻干过程中随叔丁醇升华，形成定向排列磷脂双分子层片断，由于双分子片断足够小，水化后形成了小单室的脂质体。

　　研究人员针对相变温度高的饱和磷脂，设计了另一种工艺，即将其溶于叔丁醇，在实验温度大于相变温度时注入到水中，形成脂质体，再进行冻干得到冻干脂质体。此方法可缩短冻干周期。

研究证明，将饱和磷脂DMPC-DMPG(摩尔比为7∶3)与蒽环类抗癌药Annamycin以质量比50∶1的比例溶于叔丁醇-二甲基亚砜-水共溶剂体系，并加入表面活性剂吐温-80，冷冻干燥制成冻干粉末，水化后也可得到亚微米级的脂质体。

制备非离子表面活性剂囊泡 磷脂以外的一些非离子表面活性剂，也可以与水溶性介质共溶于叔丁醇-水体系，冷冻干燥得到冻干分散体，水化后得到非离子表面活性剂囊泡。

　　制备高聚物胶团 一些高分子共聚物可以与脂溶性药物形成胶团，增加药物在水中的溶解度。通常的做法是，将高分子共聚物和药物共溶于水中，此法对于很多水溶性差的药物来说，会造成载药量减少，并且由于高分子材料自身的水溶性较差，很多时候需要将两者共同溶于有机溶剂中，然后用水透析出去。还有一种方法是形成水包油的乳剂再除去有机溶剂。这些方法都比较复杂且不经济。最近，有人将叔丁醇-水的系统引入到高聚物胶团的制备过程中，制备了紫杉醇和多烯紫杉醇的高分子胶团，取得较好效果。其方法是将药物与高分子共溶制备澄明溶液，冻干后的固体分散物加水水化后即得到小于100纳米的胶团。此工艺简单、方便，效果好，并且，叔丁醇-水共溶剂还可以回收利用，增加了大量生产的可行性。

　　■改进制剂工艺路线

　　由于叔丁醇-水共溶剂体系可以将水溶性和脂溶性的物质共同溶解在一起，溶剂可以在冻干后除去。因此，可以采用此方法对很多制剂的制备工艺进行改进。

　　蛋白质肽类的口服给药一直是当前研究的热点与难点。叔丁醇-水共溶剂系统为水溶性的蛋白质-多肽溶于油溶液提供了一种新的药物传递办法。研究人员采用叔丁醇-水共溶剂体系，冷冻干燥制备含有蛋白质-多肽的磷脂分散体，将这种冻干分散体溶于油溶液中，制成包裹水溶性蛋白质-多肽的反胶团油溶液。为了解决难溶性药物在水中的溶解度，通常采用环糊精包合技术。常规冷冻干燥采用乙醇为溶剂溶解难溶性药物，由于乙醇的溶解能力有限，通常需要使用较多的溶剂，并且含乙醇的共溶剂体系不易冻结，冷冻干燥效果不好。于是，研究人员将药物与环糊精溶于叔丁醇-水共溶剂系统，冷冻干燥一步制备形成包合物。由于叔丁醇溶解难溶性药物的能力强于乙醇，且冻结完全，干燥迅速，此方法提供了一种方便的制备环糊精包合物的新工艺。

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　 　叔丁醇作为冻干剂的特点

　　目前，在室温条件下可以冻结的有机溶剂主要有4种：叔丁醇、冰醋酸、环己烷和二甲基亚砜。其中，叔丁醇被认为是最适合制剂的冻干溶剂。其特点如下：

　　1、凝固点高。纯的叔丁醇在室温下（25℃）就可以冻结，与水混合后也可以在零下几度冻结，在现有的冻干机中都可以完全冻结。

　　2、叔丁醇的蒸汽压较高。蒸汽压高有利于升华，节省冻干时间。

　　3、叔丁醇与水可以任意比例混合。这一点极为重要，可以增大一些脂溶性药物在水中的溶解度，同时对一些水溶液中不稳定的药物，加入适量的叔丁醇可以抑制药物的分解，增强药物的稳定性。

　　4、叔丁醇毒性低。在冻干过程中，大部分叔丁醇可在一次干燥阶段升华，在制剂中残留量很低。

　　5、叔丁醇自身在冻结中形成针状结晶，能改变溶质的结晶方式，利于升华。而当少量的叔丁醇加入到水中形成叔丁醇-水共溶剂后，可以改变水的结晶状态，在冻结过程中形成针状结晶，具有大的表面积,同时冰晶升华后，留下了管状通道，使水蒸气流动阻力大大减小，升华速率显著提高，因此可用叔丁醇来加快冷冻干燥过程中的传质过程。

　　6、叔丁醇作为冻干溶剂的优点很多，但叔丁醇的纯度以及叔丁醇作为有机溶剂的生产安全性和回收利用问题均需引起生产者注意。

三、蛋白质药品冷冻干燥技术研究

1 引言

    由于冻干药品呈多孔状、能长时间稳定贮存、并易重新复水而恢复活性，因此冷冻干燥技术广泛应用于制备固体蛋白质药物、口服速溶药物及药物包埋剂脂质体等药品。从国家药品监督管理局数据库得知，目前国内已有注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、注射用重组人干扰素α2b、冻干鼠表皮生长因子、外用冻干重组人表皮生长因子、注射用重组链激酶、注射用重组人白介素-2、注射用重组人生长激素、注射用A群链球菌、注射用重组人干扰素α2b、冻干人凝血因子VⅢ、冻干人纤维蛋白原、间苯三酚口服冻干片等冻干药品获准上市。截止2000年2月，美国FDA已批准的生物技术药共计76个。

2 药品冻干损伤和保护机理

　　药品冷冻干燥是一个多步骤过程，会产生多种应力使药品变性，如低温应力、冻结应力和干燥应力。其中冻结应力又可分为枝状冰晶的形成，离子浓度的增加，PH值的改变和相分离等情况。

　　因此，为了保护药品的活性，通常在药品配方中添加活性物质的保护剂。它需要具备四个特性：玻璃化转变温度高、吸水性差、结晶率低和不含还原基。

　　常用的保护剂有如下几类物质：

　　a) 糖类/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖等；
　　b) 聚合物：HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等；
　　c) 无水溶剂：乙烯乙二醇、甘油、DMSO、DMF等；
　　d) 表面活性剂：Tween 80等；
　　e) 氨基酸：L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等；
　　f) 盐和胺：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等；

　　由于冷冻干燥过程存在多种应力损伤，因此保护剂保护药品活性的机理也是不同的，可以分为低温保护和冻干保护。

    对于低温保护，目前被广为接受的液体状态下蛋白质稳定的机理之一是优先作用原理。优先作用是指蛋白质优先与水或水溶液中的保护剂作用。在有起稳定作用的保护剂存在的条件下，蛋白质优先与水作用（优先水合），而保护剂优先被排斥在蛋白质区域外（优先排斥）。在这种情况下，蛋白质表面就比其内部有较多的水分子和较少的保护剂分子。优先作用原理同样适用于冷冻-融解过程。蛋白质保护剂，在溶液中被从蛋白质表面排斥，在冻结过程中能够稳定蛋白质。但是优先作用机理不能完全解释用聚合物或蛋白质自身在高浓度时保护蛋白质的现象。

　　在冻干过程中，由于蛋白质的水合层被除去，优先作用机理不再适用。对于冻干保护机理，仍在研究探讨之中，目前主要有两种：

　　a) 水替代假说。许多研究者认为由于蛋白质分子中存在大量氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的羟基能替代蛋白质表面的水的羟基，使蛋白质表面形成一层假定的水化膜，这样可保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质因冻干而变性，使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下，仍保持蛋白质结构与功能的完整性。

　　b) 玻璃态假说。研究者认为在含保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足够大且保护剂的结晶不会发生时，保护剂-水混合物就会玻璃化。研究发现在玻璃态下，物质兼有固体和流体的行为，粘度极高，不容易形成结晶，且分子扩散系数很低，因而具有粘性的保护剂包围在蛋白质分子的周围，形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体，使大分子物质的链段运动受阻，阻止蛋白质的伸展和沉淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定，从而起到保护作用。

　　目前大部分学者赞同"水替代假说"，因为可以通过实验检测到蛋白质和保护剂之间的氢键，为理论提供证据。事实上，无论是"水替代假说"还是"玻璃态假说"，它们的基础都是基于药液实现了部分或全部玻璃化冻结。

4 冻干工艺及优化

　　由于药品冷冻干燥过程会产生多种应力，对冻干药品的药性有很大的影响，因此对药品冷冻干燥过程进行合理设计，对于减少冻干损伤和提高冻干药品的质量有重大的意义。

  4.1冻结研究

　　冷冻干燥过程中的冻结过程非常重要，因为在冻结中形成的冰晶形态和大小以及玻璃化程度不仅影响后继的干燥速率，而且影响冻干药品的质量。因此在冻结过程中必须考虑配方、冻结速率、冻结方式、以及是否退火等问题。

    4.1.1 配方的影响

　　配方中的固体含量会影响冻结和干燥过程。如果固体含量少于2%，那么冻干药品结构的机械性能就会不稳定。尤其在干燥过程中，药品微粒不能粘在基质上，逸出的水蒸气会把这些微粒带到小瓶的塞子上，有时甚至会带到真空室当中。

　　此外，为了获得均匀一致、表面光滑、稳定的蛋白质药品，配方中必须含有填充剂、赋形剂、稳定剂等保护剂，这些保护剂对实现药品的玻璃化冻结有重大的影响。很多糖类或多元醇经常被用于溶液冻融和冻干过程中非特定蛋白质的稳定剂，它们既是有效的低温保护剂又是很好的冻干保护剂，它们对冻结的影响取决于种类和浓度。文献对不同的保护剂进行了详尽的研究，探讨了它们的冻结特性。文献还研究了其它保护剂的冻结特性。但是蛋白质种类很多，而且物理化学性质各异，因此不同的蛋白质需要不同的保护剂配方，因此它们的冻结特性就不同，一般需要实验。

4.1.2 冻结方式

　　冻结方式不同，产生的冰晶的形态和大小就不同，而且会影响后继的干燥速率和冻干药品质量。根据冻结机理，可以把冻结分为全域过冷结晶和定向结晶两类。

　　全域过冷结晶是指全部药液处于相同或相近的过冷度下进行冻结的方式。在全域过冷结晶中，冻结速率和冰晶成核温度是重要的参数。

　　全域过冷结晶按冻结速率的快慢可分为慢速冻结和快速冻结。快速冻结的冰晶细小，而且没有冻结浓缩现象，但是存在不完全冻结现象。相反，慢速冷却产生较大的冰晶，并且存在冻结浓缩的现象。Thomas W Patapoff等人发现如果把药品直接浸入液氮或干冰-乙醇溶液槽中（快速冻结），那么晶核首先在瓶壁产生，然后冰晶向中心扩散，再垂直向上扩散。由于长成的冰晶细小，而且有水平方向的结构，导致干燥阶段的传质阻力很大，升华速率降低。实验证明，快速冻结导致升华速率低，解吸速率快，慢速冻结导致升华速率快，解吸速率慢。

　　James A Searles等人认为冰晶成核温度是全域过冷结晶的重要因素，因为它是升华速率的主要决定因素。他们在研究中发现，冰晶成核温度从本质上来说是随机的、不稳定的，不容易控制，但是受溶液中的微粒含量和是否存在冰晶成核体等影响因素。正是冰晶成核温度的随机性导致升华干燥速率的不均匀性以及与形态相关的参数，如冻干药品表面积和解吸干燥速率。

　　定向结晶是指一小部分药液处于过冷状态下进行冻结的方式。Thomas W Patapoff介绍了一种垂直冻结方式。溶液用湿冰冷却，在瓶子底部用干冰冷却，形成晶核，然后放到-50℃的搁板上冻结。用这种方式冻结的样品的冰晶在垂直方向呈现烟囱状，在药品表面没有冻结浓缩层，而且整个药品的结构均一性很好，因此在干燥时的传质阻力很小，加快了冻干速率。Martin Kramer等人采用了另外一种方式实现了定向冻结。他们在真空室压力为0.1kPa，搁板温度为+10℃的条件下，让溶液开始表面冻结，形成1～3mm左右的冰晶薄层。然后解除真空，降低搁板温度到结晶温度以下进行冻结。在这种条件下长成的冰晶粗大，也呈烟囱状。同时在干燥阶段发现，升华干燥时间比采用一般冻结的时间节省了20%。分析冻干药品时还发现，对甘露醇，采用这种方式冻结的冻干品的剩余含水量比采用一般冻结的要多；但对蔗糖和甘氨酸，两者差别不大。H Schoof等人在冻干胶原质时也采用了定向结晶的方式。

　　冻结方式不同，产生的冰晶形态和大小就不同，后继的干燥速率也不同。实验证明，采用定向结晶方式的冻结药品的干燥速率比全域过冷结晶的快。但是无论采用哪种冻结方式，药品溶液必须部分或全部实现玻璃化冻结，以保护药品药性。

    4.1.3 退火
　　退火是指把冻结药品温度升到共熔温度以下，保温一段时间，然后再降低温度到冻结温度的过程。在升华干燥之前增加退火步骤，至少有三个原因：

　　a) 强化结晶。在冻结过程特别是快速冻结过程中，配方中结晶成分往往来不及完全结晶。但是如果该成分能为�